La iglesia, acreditada representante del «estilo Reyes Católicos» –último gótico hispano–, en el costado de la gran fachada plateresca, es una esbelta nave con capillas entre contrafuertes. En su interior, el claustro renacentista, con resabios de estructura tardogótica, organiza un complejo conjunto del que pueden visitarse tres salas. Dos de éstas forman el espacio más atractivo y genuino del edificio, la antigua sacristía, auténtica exhibición de ornato escultórico, obra maestra de Juan de Badajoz el Joven, su artífice en 1549, como puede leerse en su autorretrato sobre la entrada de la estancia.
Ambas salas se dedican hoy día a ofrecer al visitante un perfil sobre la historia e interpretación de este monumento –De lo que fue San Marcos–, así como una selección de los bienes que poseyó en su día –De lo que tuvo San Marcos–, entre los que se cuentan dos series pictóricas de tipo iconográfico: la de retratos de caballeros de la Orden de Santiago y la de escenas del Génesis.
Finalmente, una tercera estancia, llamada sala «del claustro» se dedica a los distintos usos del edificio tras la desamortización, ya en manos del Estado. Fue entonces cuando empezó la relación de San Marcos con el Museo de León, pues ésta fue su casa desde su apertura pública en 1869 hasta la inauguración de su nueva sede (en el edificio «Pallarés») en 2007. Desde entonces sus antiguas salas son anexo monumental del Museo.
Además, a determinadas horas y en grupos guiados, también puede visitarse la sillería del coro, obra maestra de Guillermo Doncel, Juan de Juni y Juan de Angers, ejecutada entre 1537 y 1543 en nogal sin policromar, y una de las mejores piezas en su género y época de nuestro país.
